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应用不同组装的磷脂酰胆碱对牛精浆蛋白的隔离:一种新的技术方法——材料和方法

来源:上海谓载 浏览 6 次 发布时间:2021-12-20

2.材料和方法


2.1.材料


主要构成重构膜外小叶的脂质购自Avanti Polar Lipides(美国阿拉伯斯特市阿拉伯斯特市),并按接收时使用。化合物1-棕榈酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PC(16:0/22:6),分子量=806.1,纯度>99%)和1-(1Z-十八烷基)-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱PC(P-18:0/22:6,分子量=818.2,纯度>99%)作为氯仿溶液(10mg-mL)获得?1).将PC(16:0/22:6)和P-PC(18:0/22:6)的储备溶液稀释至1.25 mg mL?1解决方案。以绵羊毛胆固醇(Chol,Mw=711.0,纯度>98%)和鸡蛋鞘磷脂(SM,Mw=386.7,纯度>98%)为粉末。二者均以1.25 mg/mL的浓度溶解于氯仿(HPLC级,法国瓦尔德鲁伊尔Carlo Erba)?1.


低温保护培养基由Trizma碱(173.0 mM)、一水合柠檬酸(70.0 mM)、果糖(56.0 mM)、甘油(6.4%;v/v)和抗生素(青霉素G钠391 mg L)组成?1,硫酸链霉素856 mg L?1,盐酸林可霉素204 mg L?1,硫酸大观霉素四水合物585 mg L?1)(西格玛-奥尔德里奇,法国圣昆廷法拉维尔)。将pH值调整为6.2,其渗透压约为1300.0 mOsm。


2.2.低密度脂蛋白的提取


根据Moussa等人的方案,从蛋黄中提取低密度脂蛋白(LDL)[31]。提取后,将低密度脂蛋白浓缩提取物(22±0.5 g,相当于8.36 g干低密度脂蛋白)在低温保护介质(100 mL)中稀释。通过micro BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce,Thermoscitific,France)对LDL样品中的蛋白质进行定量,得出8.9±1.0 mg-mL?1.LDL样品中PC磷脂的含量是根据鸡蛋中PC的自然比例(18.4 g PC/100 g干LDL)计算得出的,Givenbyonton等人[33]。它等于15.4克升?1份低密度脂蛋白样品。LDL也含有一小部分PE(PC/PE 6:1)[33]。


2.3.精浆收集


从一头Prim Holstein公牛身上收集牛精子,并立即以10000×g离心两次,以回收上清液中的精浆。我们样品的蛋白质含量为88.5±5.0mg-mL?1,由micro BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce,Thermoscitific,法国)测定。


2.4.脂质体的制备


脂质体由冷冻保护缓冲液中的卵磷脂提取物通过使用Avanti Polar Lipides(美国阿拉巴马州阿拉巴马州阿拉巴马州阿拉巴马州阿拉巴马州)的微型挤出机挤出而制备。卵磷脂提取物由磷脂酰胆碱(73%)和磷脂酰乙醇胺(11%)以及甘油三酯和鞘磷脂等次要成分组成。提取物在低温保护缓冲液中水合过夜,脂质浓度分别为3.90 mg-mL?1(C1),7.28毫克/毫升?1(C2),14.56毫克/毫升?1(C3)和21.84毫克/毫升?1(C4)。然后在超声波浴中对分散液进行15分钟的超声波处理(Elmasonic S 30H,来自德国Singen Elma,功率为275W)。最后,在挤出机中挤出分散体(20次穿过100 nm的膜)。分布尺寸集中在120nm,Zeta电位值为?6毫伏。在BSP存在下引入的脂质体量以重量表示(脂质体分散体C1、C2、C3和C4分别为1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg和6.55 mg的脂质)。不确定度为0.01 mg。


2.5.电泳


十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在还原条件下进行。将精浆溶解在pH值为6.8的缓冲液中,该缓冲液由Tris 0.5 M、SDS 10%、甘油30%w/w和溴酚蓝0.4%组成,以获得1mg mL?1解决方案。添加9%巯基乙醇v/v,并旋转样品,随后在95°C下加热5分钟。然后,将10μL低范围分子量标准品(试剂盒O6U-0511,来自法国Souffelweyrsheim的Euromedex)和10至25μL精浆装载在15%聚丙烯酰胺凝胶(pH 6.8-Tris 0.5 M和SDS 0.10%)上,并与由Tris 0.025 M、甘氨酸0.192 M和SDS 0.1%组成的pH 8.3迁移缓冲液耦合。在20 mA时进行电泳,并用考马斯蓝溶液G250对凝胶进行染色。最后对染色凝胶进行扫描,并使用Multi-Gauge软件(2.0版,日本富士照片胶片有限公司)评估峰值强度。


2.6.表面活性测量


吉布斯膜(由精浆溶液扩散到空气-缓冲界面形成)的表面张力在安装在朗缪尔天平(Microtoul XL-LB,Kibron Inc.,Helsinki,芬兰)上的15孔板(带特氟隆边缘的铝底多孔板)上测量,该天平配有高灵敏度传感器(使用合金丝的Wilhelmy方法)。将该装置置于固定在23°C的温度控制区内,并用纯蒸馏水(美国密理博公司的Milli-Q系统)进行校准。测量精度为0.1 mN/m。将精浆放入第一个孔中,然后在下一个孔中用因子2稀释,依此类推(每个孔的体积为300μL)。每种精浆提取物重复测量4次(n=2)。结果表示为所有测量的平均值。


蛋白质膜的压缩等温线是在之前配备传感器的朗缪尔槽(MicroTour XL-LB,Kibron Inc.,芬兰赫尔辛基)上测量的。精浆首先在冷冻保存缓冲液(1/100)中稀释,并在缓冲液表面逐滴(50μL)扩散。平衡20分钟后,在室温(23°C)下记录压缩等温线。


2.7.精子膜外小叶脂质结构域的重建


精子膜外小叶的脂质结构域如前所述重建[35]。朗格缪尔槽(302LL,NIMA技术,英国)被插入一个自制的手套箱上,放置在抗振动台上,用氩气冲洗,以避免脂质氧化。表面压力的测量精度为0.1 mN/m,使用滤纸制成的一块极板(英国肯特郡迈德斯通惠特曼国际有限公司生产的无灰惠特曼色谱纸)与电子天平相连。环境温度固定在20°C。将所有烧瓶和注射器放入手套箱中,然后用氩气脱气1小时,然后铺展单层。朗缪尔天平的温度由设置为40°C的循环水系统进行恒温控制。缓冲液表面的实际温度为34°C。亚相由低温保护介质组成。将胆固醇、鞘磷脂、P-PC(18:0/22:6)和PC(16:0/22:6)的氯仿溶液以适当的摩尔比(31:14:16:39)用25μL微型注射器(精确到0.5μL)逐滴涂于缓冲液亚相上(Hamilton Bonaduz AG,Bonaduz,Switzterland)。单层保持平衡10分钟,然后以40 cm2/min的屏障速度开始压缩。一旦达到目标压力(25 mN/m),通过调整可移动屏障的表面积保持压力恒定。由于单分子层在30 mN/m时不够稳定,这是与双层中脂质堆积密度相关的膜压力[36],我们将目标压力降低到25 mN/m,其中单分子层更稳定(见结果)。


一旦达到目标压力(25 mN/m),将其保持1000 s,然后使用弯曲针管将ayx爱游戏体育分子(LDL、BSP或脂质体)溶液引入亚相。针头弯曲远离针尖,并位于槽的底部,以便在压缩的亚相下方进行注射。之前将当量体积(每种添加剂0.3 mL)移到屏障后面。注射ayx爱游戏体育分子后,监测每个脂质分子的面积变化,并表示为相对于初始值的变化(a/a=(a?A(t0)×100/A(t0)。它已经被跟踪了3000秒,相当于冷冻保存前处理精液的时间。在这种恒压模式下,ayx爱游戏体育分子插入脂质单层导致膜压力增加,而膜压力通过增加表面积而降低。相反,如果ayx爱游戏体育分子导致脂质单层溶解在亚相中,则表面积减小。重复所有数据,偏差不超过表面积的5%。


2.8.低温透射电子显微镜(Cryo TEM)


使用低温插入式低温固定装置(美国加坦)制备用于低温TEM观察的试样,其中一滴水悬浮液沉积在辉光放电多孔型碳涂层格栅(美国Ted Pella公司)上。然后,通过将含有试样的液滴吸干到支撑碳膜孔上残留的薄层液体上,制备TEM网格。通过将格栅快速插入液氮冷却的液态乙烷中,使液膜玻璃化。玻璃化标本安装在Gatan 910标本架(美国Gatan)中,使用CT-3500-cryotransfer系统(美国Gatan)将其插入显微镜中,并用液氮冷却。然后从保存在玻璃质冰中并悬浮在支撑碳基质上的孔中的标本获得TEM图像。


在低剂量条件下观察样品(<10 e?/A2),在?178°C,使用JEM 1230“Cryo”显微镜(日本Jeol),在80 kV下运行,并配备LaB6灯丝。所有显微照片均记录在Gatan 1.35K×1.04K×12位ES500W CCD相机上。为确保观察的良好重复性,从几个样品制备中采集了一系列超过50张的图像,放大率不同。